Дальние бомбардировщики ДБ-3 и их модификация ДБ-3Ф (Ил-4) принимали участие в советско-финской войне зимой 1939–1940 годов, в Великой Отечественной войне и в советско-японской войне.
В 1939 году ДБ-3 начали использовать в Китае. При рейдах на Ханькоу удалось сжечь 140 японских самолётов, при потере всего трёх своих.
В финской войне самолёты наносили удары по резервам, узлам коммуникаций, портам, городским объектам, по дотам линии Маннергейма. ДБ-3 показал свою высокую эффективность. Однако отмечалось, что самолёт имел заднюю центровку, что делало его неустойчивым в полёте.
С началом Великой Отечественной войны ДБ-3 и ДБ-3Ф вступили в бой, удары наносились по танковым группировкам противника и другим целям. Бомбардировщики несли при дневных вылетах большие потери.
8 августа 1941 года произошёл первый налёт советской авиации на Берлин. Взлетев с аэродрома Кагул на острове Эзель (Моонзундский архипелаг), пятнадцать самолётов под командованием полковника Евгения Преображенского за четыре с половиной часа добрались до немецкой столицы и сбросили на неё свой бомбовый груз.
ДБ-3 продолжили летать на советско-германском фронте до 1943 года. Использовались, в частности, для буксировки планеров.
Последним эпизодом боевого применения ДБ-3 стала война с Японией, когда совместно с Ил-4 они бомбили порты и корабли.
Всего построили больше 5000 самолётов, которые внесли свой вклад в Победу советского народа над фашизмом.